pShuttle-CMV-N-Myc自行用于在哺乳動物細(xì)胞中表達N端Myc tag(Myc標(biāo)簽)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質(zhì)粒。本穿梭質(zhì)粒構(gòu)建后,需要和預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(8107)以及重組腺病毒包裝細(xì)胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle-CMV-N-Myc含有CMV啟動子可以高效啟動目的蛋白在細(xì)胞中的表達;在多克隆位點的5'端含有一個可以編碼Myc標(biāo)簽的序列,因此可以表達出含有Myc標(biāo)簽的融合蛋白,可以方便地使用抗Myc的抗體來識別目的蛋白,有利于目的蛋白檢測和分離純化。
本質(zhì)粒為卡那霉素抗性。
重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見的用于在培養(yǎng)細(xì)胞或動物體內(nèi)表達外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細(xì)胞范圍廣、感染不依賴細(xì)胞分裂、高滴度及目的基因表達水平高等特性。常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒,刪除了在病毒裝配過程中起關(guān)鍵作用的E1基因和非必須的能表達逃避宿主免疫的E3基因,E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復(fù)制,同時給外源基因的插入提供了空間,最長可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細(xì)胞作為包裝細(xì)胞就可以完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle系列的穿梭質(zhì)粒攜帶外源目的基因,經(jīng)過Pme I線性化,隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(8106)共轉(zhuǎn)染到大腸桿菌BJ5183中,或者轉(zhuǎn)染到已經(jīng)已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(8107)中同源重組。BJ5183菌株表達recET基因,具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性,使帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1通過末端反向重復(fù)序列同源重組,實現(xiàn)外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細(xì)胞中進行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒。
目的基因引入時不能含有Pme I及Pac I這兩個酶切位點,如果含有該兩個酶切位點的目的基因,需要對該位點進行突變方可進行基因操作。
pShuttle-CMV-N-Myc質(zhì)粒的主要信息如下:
Feature Nucleotide | Position |
left inverted terminal repeat | 1–103 |
encapsidation signal (ES) | 183–331 |
CMV promoter | 341–933 |
Myc tag | 955-984 |
multiple cloning site | 986–1034 |
SV40 polyA | 1051–1262 |
Ad5 right arm homology | 1267–3522 |
Ad5 left arm homology | 3570–4452 |
right inverted terminal repeat | 4453–4556 |
pBR322 origin | 4763–5430 |
kanamycin resistance ORF | 6239–7030 |
pShuttle-CMV-N-Myc質(zhì)粒的圖譜如下:
pShuttle-CMV-N-Myc的多克隆位點的的詳細(xì)圖譜見說明書
pShuttle-CMV-N-Myc中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-N-Myc)包括:
Acc65 I | Afl II | Age I | Asc I | Asp718 |
Blp I | BsiC I | BsiW I | BstB I | Bsu36 I |
Cla I | Eco72 I | EcoN I | Esp I | Fse I |
Kpn I | Nru I | Pml I | Pvu I | Sfi I |
pShuttle-CMV-N-Myc中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-N-Myc)包括:
BsrGI | T`GTAC,A | 193 | HpaI | GTT|AAC | 1156 |
SnaBI | TAC|GTA | 679 | PflMI | CCAN,NNN`NTGG | 1934 |
NheI | G`CTAG,C | 940 | BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 2373 |
NotI | GC`GGCC,GC | 945 | BbsI | GAAGAC 8/12 | 3175 |
BamHI | G`GATC,C | 986 | BbvII | GAAGAC 7/11 | 3176 |
HindIII | A`AGCT,T | 992 | Bst1107I | GTA|TAC | 3529 |
EcoRV | GAT|ATC | 1000 | XcaI | GTA|TAC | 3529 |
SalI | G`TCGA,C | 1004 | PmeI | GTTT|AAAC | 3550 |
MluI | A`CGCG,T | 1010 | EcoRI | G`AATT,C | 3555 |
BglII | A`GATC,T | 1016 | AvrII | C`CTAG,G | 4097 |
PaeR7I | C`TCGA,G | 1022 | BspHI | T`CATG,A | 5493 |
XhoI | C`TCGA,G | 1022 | Psp1406I | AA`CG,TT | 5892 |
XbaI | T`CTAG,A | 1028 | RsrII | CG`GWC,CG | 6898 |
SpeI | A`CTAG,T | 1034 | DraIII | CAC,NNN`GTG | 7245 |
ScaI | AGT|ACT | 1039 | XmnI | GAANN|NNTTC | 7499 |
pShuttle-CMV-N-Myc質(zhì)粒中推薦使用的測序引物序列如下:
forward primer (888-907): 5′GGTCTATATAAGCAGAGCTG3′
Reverse primer (1048-1070): 5′GTGGTATGGCTGATTATGATCAG3′
pShuttle-CMV-N-Myc的全序列信息:pShuttle-CMV-N-Myc.txt。
包裝清單:
產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D8137-1µg | pShuttle-CMV-N-Myc | 1μg |
D8137-100µg | pShuttle-CMV-N-Myc | 100μg |
— | 說明書 | 1份 |
-20℃保存。
注意事項:本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途,也不得移交給訂貨人所在實驗室外的任何個人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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