在現代生命科學研究中，基因敲除（Knockout, KO）細胞株已經成為探索基因功能、驗證藥物靶點、模擬疾病機制的核心工具。依托CRISPR/Cas9技術，科研人員可以對特定基因進行精準、yonjiu性失活，極大提升了實驗效率和可靠性。

但要獲得一個穩定、高質量的KO細胞株并不簡單。從gRNA設計到克隆驗證，每個環節都至關重要，稍有疏忽就可能前功盡棄。本文將為你系統梳理構建KO細胞株的標準流程，幫助你高效推進研究、提升發表成功率。

細胞系構建流程

利用 CRISPR 構建基因敲入細胞系通常需要經過一系列核心步驟。首先是 sgRNA 的設計，其特異性直接決定了編輯的成功率和脫靶風險。選擇靶點時必須保證鄰近存在 PAM 序列（如 NGG），同時避免與基因組其他區域高度相似。

其次是供體模板的構建。供體模板一般由外源序列和兩端同源臂組成，可以是雙鏈 DNA，也可以是單鏈 DNA。根據實驗需求，還可以在模板中嵌入抗性基因或熒光標簽，以便后續篩選。

在遞送環節，Cas9 和 sgRNA 可通過質粒、電轉、病毒載體或 RNP 復合物的方式導入細胞。選擇合適的遞送方式對編輯成功至關重要，不同的細胞類型通常需要針對性優化條件。

完成轉染后，細胞依賴 HDR 機制整合外源基因。由于 HDR 在細胞周期 S/G2 期更為活躍，因此研究人員常通過藥物或同步化手段提高敲入效率。接下來，利用 PCR、測序、Western blot 或熒光檢測等方法進行鑒定，篩選陽性克隆，并通過單克隆擴增建立穩定細胞系。最終獲得的穩轉株不僅能保持長期表達，還具有較好的遺傳穩定性。

構建基因敲除細胞株是分子生物學中一項復雜而系統的實驗流程，涵蓋從設計到驗證的每一個環節。無論你是初入實驗室的新手，還是追求高效結果的資深研究者，理解并掌握KO細胞構建的關鍵流程，都是推進科研項目、發表高分文章的重要保障。