分離囊胚的內細胞群（ICM）細胞，再進行體外培養即可取得胚胎干細胞。目前，取得胚胎干細胞的方法已有一定改進，但仍無可避免地會

殺死胚胎。

囊胚由兩大部分構成：處于外圍的滋養層以及處于內部的內細胞群。滋養層細胞會分化為胚胎外的組織（胎盤等），而內細胞群則會分化為

胚胎的各種結構。

最早期分離胚胎干細胞的方法是先用蛋白酶分解透明帶的蛋白質（囊胚外圍的一層細胞外基質），再利用免疫手術（immunosurgery）

專一地使滋養層細胞裂解，從而取得內部的內細胞群細胞，之后體外培養和繁殖取得的內細胞群細胞，即可建立胚胎干細胞系。

目前胚胎干細胞的分離方法已有了一定的改進，比如現在已有使用激光去除透明帶的技術。

獲取胚胎干細胞的成功率相當低，即使成功取得胚胎干細胞，維持其不分化的狀態也十分困難。為了阻止胚胎干細胞在培養過程中分化，

培養基需加入如白血病抑制因子（LIF）等因子。最初，胚胎干細胞需要在含有喂養層細胞的培養基上培養。

喂養層細胞能為胚胎干細胞提供特定的微環境，以抑制胚胎干細胞的分化。喂養層細胞常常使用經過有絲分裂阻斷劑處理過的胚胎成纖維細胞

。目前已能在成分清楚、無異物、不含有血清以及喂養層細胞的培養基上培養胚胎干細胞。