免疫熒光染色是實驗室常用的技術之一，但在操作過程中，有許多需要注意的細節，任何一個環節的失誤都可能導致實驗失敗。本文將為您介紹免疫熒光染色的注意事項。

1. 抗體選擇：選擇針對您研究的目標蛋白特異性高、親和力強的抗體，一抗的濃度需要預實驗摸索。一抗濃度過高(本身熒光實驗，一抗的濃度就較高)，也是造成自發熒光強的重要原因。

2. 抗體稀釋：根據抗體說明書建議，使用合適的稀釋液和稀釋比例進行抗體稀釋。

3. Blocking：使用合適的Blocking 液進行Blocking 處理，以減少非特異性結合，一般采用動物血清，在室溫下封閉1h左右。建議適當延長封閉的時間至2h。如果室溫較低，可以考慮采用37℃孵育箱進行封閉，優化封閉時間，充分去除組織中的類屬抗原。

4. 二抗選擇：選擇與一抗種屬匹配的熒光標記二抗，二抗在4℃長時間放置后可能有部分熒光素沉淀，導致染色結果有星星點點的雜質，損失珍貴樣本！建議配成工作液后，高速離心，取上清使用。

5. 洗滌：在每一步操作后，充分洗滌以去除未結合的抗體和染料。

6. 封片：選擇合適的封片劑進行封片，避免熒光淬滅。

7. 對照設置：設置合適的陽性和陰性對照，以確保實驗結果的可靠性。

封片技巧：

在滴加封片劑之前，確保切片上沒有多余的液體。封片劑也不宜添加過多，可用10ul槍頭吸取少量，點在每個樣品邊緣，緩慢蓋片。

滴加適量的封片劑，避免產生氣泡。

用10ul槍頭滴加~5ul/樣品（根據組化筆大小 酌情更改封片劑滴加量） 千萬不可打出氣泡！不要把槍頭最后一滴封片劑打出！氣泡會嚴重影響封片效果！

如果不小心產生氣泡 → 可以用鑷子輕輕將氣泡擠出。

使用干凈的蓋玻片，輕輕按壓，使封片劑均勻覆蓋切片。

避免在蓋玻片上留下指紋或污漬。

希望 這些技巧能幫助您順利完成實驗。